檸檬酸鈉緩沖液0.01mol/L,pH6.0
簡要描述:貨 號:P0020名 稱:檸檬酸鈉緩沖液0.01mol/L,pH6.0,規(guī) 格:1L價 格:8.00
產(chǎn)品型號:
所屬分類:緩沖液
更新時間:2024-01-07
廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
| ||
1.適用范圍:適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復,其效果優(yōu)于微波修復法和直接煮沸修復法,使得免疫組化結果更加可靠;推薦使用本法. 2.儀器設備:市售不銹鋼家用壓力鍋(以不銹鋼制品為好),大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑18cm為好);1000-1500W電爐一臺;不銹鋼或耐高溫塑料切片架。 3.所需試劑:0.01M檸檬酸型緩沖液,pH=6.0±0.1 4.操作步驟: (1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后,浸泡于蒸餾水中待用。 (2)取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(800-1500ml)于壓力鍋中,大火加熱直至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋,扣上壓力閥,繼續(xù)加熱至噴汽,從噴汽開始計時,1-2分鐘后,壓力鍋離開熱源,冷卻至室溫(稍冷后,可在自來水籠頭下加速冷卻),取出玻片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次,每次3分鐘(2×3')。 (3)按公司有關試劑盒的操作步驟執(zhí)行。 5.注意事項: (1)加熱時間長短的控制很重要,從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在5-8分鐘為好,時間過長可能會使染色背景加深。 (2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架,不能使用銅架,以防緩沖液pH值增高而導致掉片。 (3)高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后,才能把切片取出。 (4)為防止組織脫落,玻片必須經(jīng)清潔處理后,涂覆Poly-L-Lysine
常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來,胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱,主要用于細胞內(nèi)抗原的消化,胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇,這樣針對性更強,標記效果更理想。 問:為什么要進行抗原修復: 答:福爾馬林固定時,組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵,使得不少抗原決定簇被封閉。同時,由于甲醛的聚合作用,使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡,也導致了抗原決定簇被掩蓋,這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此,抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素。 抗原修復中檸檬酸緩沖液的配制方法: A液:枸櫞酸,C6H8O7.H2O,21.01g 加水定容至1000ml; B液:枸櫞酸鈉,C6H5Na3O7.2H2O, 29.41g 加水定容至1000ml; 使用時: A液9 ml, B液41 ml,加水至500ml,即可配成工作液。 抗原修復(Antigen retrieval ,AR)技術,是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(IHC)前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等,使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程??乖迯湍躾ui大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性,使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果,成為一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展、應用和標準化。 一、 AR技術 微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標準方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧(化)物酶,石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗,放置在塑料Coplin缸中。加入AR液,如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等,蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘(注意防止切片干躁)。有時在加熱5分鐘后,間隔1分鐘,再加熱5分鐘(在*個5分鐘后檢測液體高度)。加熱后,從微波爐取出塑料Coplin缸,冷卻15分鐘。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘,才進行IHC染色。為了保持*的加熱條件,必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ,按照不同的抗體設定不同的加熱時間,盡可能的建立標準的加熱條件。 微波(MW)加熱過程如下:在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液(PH6.0±0.1),并蓋上帶有小孔的蓋子,微波加熱至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中,放入已沸騰緩沖液中,有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3],微波爐選用解凍檔的國產(chǎn)家用微波爐(根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐),中檔繼續(xù)處理10-20分鐘;取出微波塑料缸冷卻至室溫,從緩沖液中取出玻片,片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次,之后用PBS(PH7.2-7.4)沖洗兩次,每次3分鐘。 胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中,溶解即可;或用0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘。 鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中,濃度為o.1%,消化時間20min。 二、AR應注意的問題 加熱持續(xù)時間和強度是重要的影響因素之一, AR液的PH值、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一。 使用低PH值AR液必須使用陰性對照片,以防止定位不準[9]。Shi等人[10]強調(diào)修復緩沖液的PH值對某些抗原的修復十分重要,實驗中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結果必須選擇抗原修復液的zui適PH值。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC,采用不同濃度的Alcl3液做AR液,發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]。在修復的抗原中,金屬鹽可影響蛋白的結構。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2,于微波修復抗原,發(fā)現(xiàn)其陽性強度逐漸增強。 高溫抗原修復因其機理相當復雜,對某些存在的問題很難用設計對照的方法加以解決,有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應,但在石蠟切片用抗原修復后卻能很好的顯示。對某些應表達在胞漿或表達在核內(nèi)的抗原,經(jīng)過量修復后,絕大部分表達在核內(nèi),例如,P185、Bcl-2、P-gp、Nm23,而有些表達在核內(nèi)的抗原經(jīng)過量修復會出現(xiàn)在胞漿內(nèi),例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時一定小心,對結果的判斷也要客觀地作出分析,侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TRT)經(jīng)過抗原修復與不經(jīng)過抗原修復,其染色效果明顯不同,后者的陽性率明顯高于前者[8]。操作中還應注意如下問題: 用于IHC消化的酶很多,所選酶的種類,使用的濃度,PH值,消化時間及溫度等均要視組織固定的不同,所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異,應通過預實驗摸索, , 確定。使用酶消化的原則:胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內(nèi)抗原,如Keratin,CEA,GFAP等。胃蛋白酶則主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測,如fibronectin,Laminin,各型膠原等。一般來言,消化時間和組織固定的長短呈正比。在用酶消化,熱修復后均不能獲得結果的前提下使用抗原修復與酶消化結合的方法,有時會取得較為滿意的結果。一般蛋白酶K和微波相結合,但應注意,可能檢測的抗原無論何種性質(zhì)均會在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應[6]。 三、AR的臨床應用。 |
現(xiàn)貨供應