FITC標(biāo)記套裝

FITC標(biāo)記套裝

保存條件：FITC -20度保存，其他常溫保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：本套裝是將FITC標(biāo)記的常用試劑集合為一體而成。適合于蛋白等含有氨基物質(zhì)的標(biāo)記。特別是抗體的標(biāo)記。

如果待標(biāo)記物分子量太小（如小于5KD），可能并不適合用此套裝（主要是后期純化去除未標(biāo)記上的FITC，可選用透析袋）。

標(biāo)記原理：在高PH下FITC可蛋白等分子的氨基相連，形成共價(jià)健。

操作方法：

一，  標(biāo)記量的計(jì)算：FITC分子量為389.4。一般為FITC：待標(biāo)記物＝10：1左右。比如抗體IgG分子量一般為150－160KD。則1mg HRP可標(biāo)記抗體40mg之間。

二，  計(jì)算好各步反應(yīng)時(shí)間。作好開(kāi)始標(biāo)記的準(zhǔn)備工作。因?yàn)闃?biāo)記是在PH為9.5的條件下反應(yīng)，如果待標(biāo)記物本身鹽含量很低并且緩沖力差，如生理鹽水，可等二天再準(zhǔn)備。如果不確定，將0.2M PH9.5 CB稀釋20倍，作為透析液，將待標(biāo)記物裝入透析袋中4℃透析過(guò)ye，透析袋適當(dāng)留長(zhǎng)約1ml體積的量以備第二天加入酶（透析袋用雙蒸水清洗三次，祥細(xì)使用請(qǐng)見(jiàn)附錄）。

三，  如果樣品緩沖能力很?。ü腆w可用水溶解），加入1/20體積的0.2M PH9.5 CB，混勻。

四，  準(zhǔn)備層析柱（使用方法見(jiàn)附錄）。

五，  在樣品準(zhǔn)備好的情況下，稱(chēng)量2mg左右FITC（請(qǐng)不要一次稱(chēng)量過(guò)小，稱(chēng)量過(guò)小時(shí)，誤差會(huì)很大），加入1ml DMSO溶解。取適量溶解好的FITC，加入準(zhǔn)備好的樣品迅速混勻。避光常溫反應(yīng)兩小時(shí)或者4℃反應(yīng)過(guò)ye。

六，  加入1/20體積的1M NH4Cl，避光4℃反應(yīng)兩小時(shí)。

七，  過(guò)柱。請(qǐng)保證總?cè)芤后w積不超過(guò)總體積的1/5。比較理想的是在1/10。也就是10ml凝膠，zui多過(guò)柱1ml的標(biāo)記液（此步也可以改為透析。一般避光透析兩天左右，到?jīng)]有明顯黃色出來(lái)為止）。

附透析袋使用方法：

本透析袋已預(yù)處理過(guò)，用雙蒸水清洗后將水用適當(dāng)吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用鐵夾，但如果鐵夾不夠用，下部可用細(xì)線或者其他的透析袋夾。

將透析袋輕輕的折上兩到三折。用線或者透析袋夾封住，上面支開(kāi)，加入待透析物，留一定量的空氣在頂上，并小心的折一折，用鐵夾夾住，輕輕的擠壓，如沒(méi)發(fā)現(xiàn)有液體流出，可放入透析液中。一般透析可用純凈水瓶去頂使用。用一次性筷子或者其他合適物穿過(guò)鐵夾，將透析袋吊在透析液中，補(bǔ)充透析液，使透析液蓋過(guò)透析袋中的液面而不要淹過(guò)鐵夾下面。

分子篩柱使用方法：

取空柱，加入雙蒸水沖洗三次，找一合適的地方架好，下面收集廢液，將Sephadex G-25取出搖勻，輕輕的沿壁倒入柱中（用去尖移液器加入也可以），等液體流出少量時(shí)，不停的補(bǔ)加凝膠到一合適的體積。一般加到10ml左右。在上口留出1－2ml空間。灌完膠后，用三倍體積的雙蒸水沖洗（從上面加入，下面自動(dòng)流出），再用合適的緩沖液沖洗三倍體積（如生理鹽水或者PBS等）。

當(dāng)zui后一次加緩沖液后，把柱上層弄平整。等上層溶液*流完，就可以加入待過(guò)柱的標(biāo)記液。用去尖吸頭小心的中空滴加，如果一次加不完，等流出少量后再加，一直加完。待標(biāo)記物*流干后，再加入少量約3－5滴緩沖液（如生理鹽水或者PBS等），流完再加，如此三次左右，接著就可以一次加入1－2ml緩沖液（如生理鹽水或者PBS等）。加到一定體積后，可以看到柱中黃色會(huì)分層。收集下層溶液，加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑等，定溶。備用。

用過(guò)的凝膠可以丟棄或者重復(fù)使用（如果重復(fù)使用，須用大量的緩沖液沖洗，待上層黃色*流走。折中的方法是小心的將上層黃色膠挖掉。流下層的回收）