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SPL-230106共聚焦培養(yǎng)板,PS/Flux,TC處理 6孔,13Ø 滅菌說(shuō)明

發(fā)布時(shí)間: 2023-07-25  點(diǎn)擊次數(shù): 1211次

共聚焦成像——如何讓細(xì)胞在玻璃底培養(yǎng)皿更好地貼壁


今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿,讓細(xì)胞妥妥地貼壁,大家做共聚焦時(shí)候能夠更得心應(yīng)手。

 

   市面上常見(jiàn)的玻璃底培養(yǎng)皿,通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個(gè)洞,再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細(xì)胞爬片用無(wú)影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部。并不是整個(gè)培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的。適用于觀測(cè)的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域。但是由于玻璃的疏水性,往往在培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候,細(xì)胞不能在玻璃上很好地貼壁,生長(zhǎng)狀態(tài)并不好,甚至在做共聚焦掃描成像的時(shí)候發(fā)生細(xì)胞脫片的現(xiàn)象。


想要細(xì)胞好好貼壁,所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)之前,要確認(rèn)已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑。

 

自己動(dòng)手包被

     培養(yǎng)不同的細(xì)胞,需要的包被試劑也不同。同時(shí),因?yàn)橛糜诎坏牡鞍资巧锂a(chǎn)物,所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的,本技術(shù)帖只是提供參考,具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說(shuō)明書(shū)。并且最好以自己所用的試劑先做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn),找出適合的包被濃度。

 

     這里以 Poly-L-Lysine 為例(PLL,sigma,P4832, 100μg/ml):

 

   PLL包被適用于絕大多數(shù)細(xì)胞,尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng)。在使用時(shí)需要使單位面積上的蛋白含量(μg/cm2)達(dá)到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據(jù)包被面積,包被體積,來(lái)計(jì)算所需要蛋白質(zhì)的量。

    比如:35mm玻璃底培養(yǎng)皿,細(xì)胞生長(zhǎng)面積是3.5cm2,包被面積是4.1cm2,包被液體積是400μl,那根據(jù)推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL,如果只加入400μl的PLL溶液,那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml(約為 20μg/ml)。所以,需要用超純水將原液進(jìn)行稀釋。

 

具體步驟:

1.使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。

2.在每個(gè)35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液。

3.室溫孵育1-2小時(shí),吸出PLL稀釋液。

4.使用2ml PBS溶液或無(wú)血清培養(yǎng)基小心的清洗3次,吸盡清洗液。

5.直接加入細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。

 

方法評(píng)價(jià)

    由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同,不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經(jīng)常由于需要對(duì)玻璃底培養(yǎng)皿包被,而產(chǎn)生了新的污染。而且污染往往是開(kāi)始養(yǎng)細(xì)胞了以后才會(huì)發(fā)現(xiàn),這樣不僅耽誤了時(shí)間,而且也浪費(fèi)了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價(jià)格也是不菲的(質(zhì)量不過(guò)關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會(huì)因?yàn)槟z水沒(méi)有粘勻而漏液或者使用的膠水對(duì)細(xì)胞有毒性)。

 

無(wú)需包被的共聚焦培養(yǎng)皿

      對(duì)于想節(jié)省時(shí)間和功夫的童鞋,還是直接使用無(wú)需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些。

     選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有:是否適合自己的細(xì)胞貼壁、培養(yǎng)皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求。

     能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿,不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿,事實(shí)上,大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜、相對(duì)玻璃來(lái)說(shuō),也更容易讓細(xì)胞貼壁。這里以德國(guó)ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例,說(shuō)一下符合共聚焦實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù):


            圖  德國(guó)ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對(duì)比

 

      可以看出,符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿,它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的,但同時(shí),它們又還具有親水的特性,能讓大多數(shù)細(xì)胞更好貼壁;而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿,就可讓絕大多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞直接貼壁生長(zhǎng),而且不易碎,算是不錯(cuò)的選擇。

   大家也可根據(jù)自己具體實(shí)驗(yàn)要求,結(jié)合上述表格的參數(shù),找到最合適自己實(shí)驗(yàn)的共聚焦培養(yǎng)皿。

 

方法評(píng)價(jià)

     選擇這類培養(yǎng)皿,不需要額外包被,大大減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)。并且由于塑料底部比較易于加工,不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部。杜絕了漏液或者細(xì)胞毒性的可能。

 

高通量共聚焦實(shí)驗(yàn)耗材

  由于單個(gè)培養(yǎng)皿通量很小,如果一次要做多個(gè)樣品,操作就會(huì)比較麻煩,且試劑用量會(huì)較大,這時(shí)候可以選擇多孔的耗材,比如腔室載玻片(2/4/8孔),可以滿足研究人員需要一次進(jìn)行多通量的成像。并且相對(duì)于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿,腔室載玻片需要試劑的更少,非常節(jié)約價(jià)格昂貴的抗體,單孔實(shí)驗(yàn)的成本大大降低。

 


      現(xiàn)在也有適用于高內(nèi)涵顯微鏡和活細(xì)胞工作站的多孔板。適合全自動(dòng)成像和操作。

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