4％多聚甲醛溶液

本試劑為4％多聚甲醛，由0.1M PB溶解。未經(jīng)DEPC處理。

本試劑為-20度保存，如果經(jīng)常使用，可放2-8度。解凍后，混勻使用。

關(guān)于固定方法與時(shí)間，以及適合標(biāo)本，請自行參考文獻(xiàn)。

以下資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考。

不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響

【摘要】  目的：觀察應(yīng)用與不應(yīng)用多聚甲醛心臟灌注這兩種不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響。方法：20只新生大鼠隨機(jī)化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。灌注組經(jīng)麻醉后經(jīng)左心室插入灌流針，先灌注冰凍無菌生理鹽水再灌注4％多聚甲醛，灌注同時(shí)切開小部分肝臟，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)麻醉后直接斷頭取腦，其它固定方法同灌注組。進(jìn)行石蠟切片HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果：灌注組腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，無共染現(xiàn)象, 組織切片完整均勻，皮層及海馬區(qū)組織、細(xì)胞形態(tài)正常，未見擴(kuò)張的毛細(xì)血管。非灌注組大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細(xì)胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，核著色不良，部分視野可見擴(kuò)張的毛細(xì)血管，血管內(nèi)有血細(xì)胞樣物。結(jié)論：應(yīng)用多聚甲醛心臟灌注對新生大鼠腦組織的固定效果較好，是應(yīng)用動(dòng)物腦組織切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的*的步驟。

【關(guān)鍵詞】  新生大鼠 大腦 組織固定 組織切片

    新生大鼠腦組織切片是觀察新生大鼠腦組織病理損傷的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。在進(jìn)行腦組織切片之前，需對處死的新生大鼠鼠腦進(jìn)行固定。有文獻(xiàn)表述直接把處死的鼠腦浸泡在4％多聚甲醛溶液中固定，也有文獻(xiàn)介紹應(yīng)用在體心臟灌流術(shù)經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛后再浸泡固定方法［1］。為對比這兩種方法對新生大鼠腦組織切片的影響，我們在進(jìn)行新生大鼠實(shí)驗(yàn)中分別應(yīng)用這兩種方法，觀察直接固定與在體心臟灌流術(shù)后固定對新生大鼠腦組織切片的影響。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　多聚甲醛由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，4%多聚甲醛臨用前配制，配制后過濾去除小的雜質(zhì)，配制后放置到冰箱中，冷卻到4 ℃后使用。Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)及Olympus CHC-212生物顯微鏡為日本公司生產(chǎn)。

　　1.2  動(dòng)物分組 

　　7日齡新生SD大鼠性別不限，體重10～15 g，共20只，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號，采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。

　　1.3  新生大鼠大腦組織固定與樣本準(zhǔn)備 

　　灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后固定于自制的手術(shù)木板上，置于解剖盤中，開胸暴露并游離出心臟，切開右心房，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，灌注同時(shí)切開小部分肝臟，先灌注冰凍無菌生理鹽水（4 ℃）30～50 mL直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，后再灌注冰凍（4 ℃）4％多聚甲醛30～50 mL，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后直接斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，其它固定方法同灌注組。

　　1.4  樣本切片與HE染色 

　　切片自視交叉冠狀平面開始，切至出現(xiàn)海馬結(jié)構(gòu)，片厚5 μm，每隔5張取1張，每個(gè)標(biāo)本取10張，黏于多聚賴氨酸處理后的切片上，進(jìn)行HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。每張腦切片取左側(cè)顳頂葉皮層及左側(cè)海馬CA1區(qū)中段隨機(jī)各取6個(gè)視野拍照。

　　2  結(jié)果

    灌注組應(yīng)用4%多聚甲醛灌注過程中觀察到新生大鼠四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身強(qiáng)直現(xiàn)象。灌注組新生大鼠大腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色鮮艷，核無明顯腫脹，核漿對比度好，無共染現(xiàn)象, 組織切片更加完整均勻，鏡下與石蠟切片相似，皮層及海馬區(qū)組織、細(xì)胞形態(tài)正常。未見擴(kuò)張的毛細(xì)血管。見圖1、圖2。非灌注組新生大鼠大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細(xì)胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，細(xì)胞核著色不均，部分視野可見擴(kuò)張的毛細(xì)血管，血管內(nèi)有血細(xì)胞樣物。見圖3、圖4。
  
　　3  討論

    病理標(biāo)本的制作和組織切片都必須先進(jìn)行固定。如果固定不佳，制片的其它程序?qū)踪M(fèi)時(shí)間，沒有很好的固定，HE染色就難以進(jìn)行。新生大鼠腦組織切片常用于對新生大鼠腦形態(tài)學(xué)影響的研究，比如免疫組化、細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)。組織的固定是形態(tài)學(xué)研究中*的重要步驟。組織的固定有以下作用：抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的釋放和活性，防止自溶；抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織腐壞，使細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖等各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，以防止物質(zhì)擴(kuò)散并維持原有的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)； 固定后的組織對染料有不同的親和力，染色后可產(chǎn)生不同的折射率，顏色更為清晰鮮明，便于觀察，硬化組織，便于切片［2］。還可將抗原固定在原位，保持其抗原性，使抗原能準(zhǔn)確可靠地顯示出來［3］。在進(jìn)行動(dòng)物腦實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的固定劑中，zui常用的是多聚甲醛［4，5］。有研究認(rèn)為應(yīng)用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定效果［6］。

    我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注及腦標(biāo)本浸泡對新生大鼠腦組織的固定效果較好，組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰完整，染色滿意。而不用4％多聚甲醛心臟灌注僅腦標(biāo)本浸泡固定的效果就相對較差，組織水腫，細(xì)胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，染色欠滿意。說明應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注這一步驟*。我們分析認(rèn)為應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注可能有如下作用：①標(biāo)本血管沖洗，減少血管內(nèi)血液有形成分存留，影響切片形態(tài)學(xué)觀察。②多聚甲醛經(jīng)毛細(xì)血管快速滲入組織中起固定作用。而不進(jìn)行心臟灌注僅僅標(biāo)本浸泡，多聚甲醛可能要經(jīng)較長時(shí)間才能滲入組織中起固定作用。尤其固定較大的標(biāo)本時(shí)固定劑需更長時(shí)間才能滲入組織中。我們應(yīng)用的新生大鼠腦標(biāo)本遠(yuǎn)較大鼠小。③減少組織細(xì)胞自溶現(xiàn)象。我們實(shí)驗(yàn)未觀察到明顯的細(xì)胞自溶現(xiàn)象。但部分細(xì)胞腫脹，可能由于腦標(biāo)本尚小的原因，不排除對于較大標(biāo)本會(huì)進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞自溶現(xiàn)象。

【參考文獻(xiàn)】
  　?。?］劉乃慧，張莉，邵穎，等. 在體心臟灌流術(shù)在大鼠腦組織切片觀察中的應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2005，22（2）：52－53.

　?。?］黃宏森，張超，郭曉珍，等. 不同固定液及固定時(shí)間對小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，35（2）：65－68.

　?。?］郁毅剛，徐如祥，姜曉丹，等. 固定方式對神經(jīng)細(xì)胞膜NMDAR1免疫細(xì)胞化學(xué)定位的影響［J］.*軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（4）：379－385.

　?。?］雷種，成丹丹，王百忍，等. 局灶性腦缺血再灌注后大鼠下丘腦pSTAT3陽性神經(jīng)細(xì)胞分布與局部微血管的關(guān)系［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2007，27（9）：827－830.

　　［5］葛鵬飛，羅毅男，付雙林，等. 缺血再灌注對大鼠海馬CA1及DG神經(jīng)元內(nèi)19S蛋白酶體影響的激光掃描共聚焦顯微鏡研究［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（12）：1216－1218.

　?。?］賀莉萍，郭毅，蒙艷斌，等. 固定劑和固定時(shí)間對石蠟包埋組織RT-PCR檢測病毒RNA的影響［J］.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，2005，32（1）：11－15.