一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
簡(jiǎn)要描述:貨 號(hào):C0530名 稱:一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒規(guī) 格:20T/50T價(jià) 格:1680.00/2880.00CAS:FITC顯色
產(chǎn)品型號(hào):
所屬分類:其他自產(chǎn)即用試劑
更新時(shí)間:2024-01-07
廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
試劑盒組成 | 25T | 50T |
TdT酶 | 25微升 | 50微升 |
FITC-dUTP | 25微升 | 50微升 |
5×ReactionBuffer | 400ul | 2×400ul |
ddH2O | 1.25ml | 2×1.25ml |
保存條件:
-20℃保存,FITC-dUTP需避光保存。如果經(jīng)常使用,FITC-dUTP和5×ReactionBuffer可放2-8℃保存。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為您提供了一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡早期檢測(cè)方法。對(duì)于經(jīng)過(guò)固定和洗滌的細(xì)胞或組織,只要經(jīng)過(guò)一步染色反應(yīng),洗滌后就可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí),會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA?;蚪MDNA斷裂時(shí),暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP),從而可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),這就是TUNEL(TdT--mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。
操作步驟
1.a.對(duì)于細(xì)胞片或者冰凍切片,常規(guī)固定,PBS或HBSS洗滌3次(可選步驟:用含0.1% Triton X-100的PBS孵育2分鐘。)。
b.對(duì)于石蠟切片,常規(guī)脫蠟透水,滴加20μg/ml蛋白酶K,20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的*作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。PBS或HBSS洗滌3次。注意:這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈,否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
2.配制TUNEL檢測(cè)液:按比例,每個(gè)樣品,取10ul 5×Reaction Buffer,加入38ul ddH2O,加入1ul FITC-dUTP,加入1ul TdT酶,混勻。(如果zui后背景較深,可適當(dāng)減少FITC-dUTP和TdT酶)
3.在樣品上加入50μl TUNEL檢測(cè)液,37℃避光孵育30-60分鐘。配制好的TUNEL檢測(cè)液必須一次使用完畢,不能凍存。注意:孵育時(shí)需注意保濕,盡可能的在濕盒中孵育,以減少TUNEL檢測(cè)液的蒸發(fā),如果標(biāo)本較小,可適當(dāng)?shù)臏p少試劑的用量。
4.PBS或HBSS洗滌2次。
5.用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565nm(綠色熒光)。
6.對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液:可以收集不超過(guò)106個(gè)細(xì)胞,同樣固定,清洗,染色,清洗,zui后用250-500μlPBS或HBSS懸浮,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。
常見(jiàn)問(wèn)題:
1.出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記。
a.有些細(xì)胞或組織,例如平滑肌細(xì)胞或組織,nuclease或polymerase的酶活性水平較高,易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是,取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定,以阻止這些酶導(dǎo)致假陽(yáng)性。
b.使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?,例如一些酸性固定液,?dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議采用推薦的固定液。
c.TUNEL檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),或TUNEL檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)液滲漏,細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn),也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間,并確保TUNEL檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2.熒光背景很高。
a.支原體污染。
b.高速分裂和增殖的細(xì)胞,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c.TUNEL反應(yīng)過(guò)強(qiáng)。減少酶和FITC-dUTP的加入量。
d.紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。
3.標(biāo)記效率低。
a.使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b.固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
c.在加標(biāo)記液衣,可以用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞,冰浴孵育2分鐘。
d.熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
e.碘化丙啶雙染時(shí),如果碘化丙啶染色過(guò)深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光,從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色,例如0.5微克/毫升碘化丙啶。