NC膜、PVDF膜、尼龍膜的應(yīng)用及差別

NC膜、PVDF膜、尼龍膜的應(yīng)用及差別

硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡(jiǎn)稱NC膜)，NC膜在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到，雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測(cè)核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。 

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20000的蛋白選用0.45um的膜，小于20000的蛋白選用0.2um的膜。PVDF膜使用是需預(yù)處理，用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。PVDF膜具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，是印跡法中的理想固相支持物材料。 
尼龍膜是一種合成的長(zhǎng)鏈聚酰胺薄膜，對(duì)核酸和蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，能代替硝酸纖維素薄膜用于分子印跡和雜交實(shí)驗(yàn)。 
NC膜、PVDF膜、尼龍膜的差別：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物，價(jià)格*；PVDF膜介于二者之間。 
1. 就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80－100μg/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125－300μg/cm2。 
2. 就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。 
就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。 3. 就重復(fù)性而言： 
⑴、尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。 
⑵、NC膜的使用也很簡(jiǎn)便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在無(wú)離子水面浸潤(rùn)排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，不過(guò)要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途。因?yàn)榻?jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結(jié)合力會(huì)有所降低。 
⑶、由于NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮妫虼嗽诜忾]時(shí)使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過(guò)0.3%(據(jù)說(shuō)0.05%效果)。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素這在前面已經(jīng)提到，會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)合 
⑷、與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更*的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2(而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍！)。但是PVDF膜zui大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測(cè)序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，所以PVDF也是要做蛋白測(cè)序的*選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理(不超過(guò)15秒)再用緩沖液平衡，才能用。